追梦路上的大湾村

双酚A：纯度不小于99.9%，韩国LG集团。

将10L质量浓度为10mg/mL的2-辛醇和5mL待测样品混合均匀，对含有内标物的样品通过GC-MS进行分析。1.4.5 气相色谱-质谱联用分析气相色谱质谱联用分析条件：采用DB-WAX色谱柱（30m0.25mm，0.25m），进样口温度250℃。

理化分析型超纯水机（WP-UP-LH-20），四川沃特尔水处理设备有限公司。分析电子天平（HZK-FA2105），美国康州HZ电子科技有限公司。1.2 培养基的配制MRS培养基：分别称取牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、磷酸氢钾2g、无水乙酸钠5g、硫酸锰0.25g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-801mL、硫酸镁0.5g溶解于1000mL蒸馏水中，调pH值至6.2，121℃高压灭菌20min。以生理盐水作参比溶液，将菌液吸光度（OD600nm）调至0.5～0.6。1 材料与方法1.1 材料与试剂豆浆粉购于永和食品（中国）股份有限公司。

其中，挥发性香气成分的增加或生成是发酵豆浆提升感官品质的重要因素。1.4.2 菌株活化与接种5种乳酸菌包括：植物乳杆菌FZU122、干酪乳杆菌FJAT-7928、德式乳杆菌FJAT-46740、发酵乳杆菌FJAT-46744、嗜热链球菌FJAT-46738，由甘油管分别接种至MRS液体培养基37℃静置培养，经活化、转接培养后，取一定量菌液离心，去除上清液，用生理盐水洗涤3次。随着营养态酵母或野生型酵母孢子质量浓度的增加，巨噬细胞吞噬营养态酵母和野生型孢子的数目呈上升趋势。

1.11 野生型孢子和突变体孢子吞噬实验取1mg的野生型酵母孢子、ditl△孢子和chs3△孢子，按照1.6方法进行吞噬实验。如图2(b)所示，与对照组相比，渥曼青霉素对巨噬细胞吞噬酵母和葡聚糖微球无显著影响。相关链接：甘露糖，半乳糖，乳糖，青霉素声明：本文所用图片、文字来源《食品与生物技术学报》，版权归原作者所有。检验标准P＜0.05表示差异有统计学意义，每次实验重复5次。

已有的研究表明，巨噬细胞吞噬葡聚糖微球依赖于Syk，通过白皮杉醇抑制Svk能够抑制巨噬细胞对葡聚糖微球的吞噬。利用Svk抑制剂白皮杉醇阻断Svk所介导的信号通路见图2(a)。

这表明尽管野生型孢子直径小于营养态酵母.其吞噬途径是极其依赖于P13K的过程.而营养态酵母的吞噬过程不是显著依赖于P13K的过程。当营养态酵母和孢子质量均为lmg时，巨噬细胞吞噬营养态酵母和孢子的情形见图l(b)。随着渥曼青霉素质量浓度的增加，其对巨噬细胞吞噬野生型酵母孢子的抑制作用增强1.4 主要试剂和仪器主要试剂有：DMEM高糖培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，昆布糖(Sigma)，葡聚糖微球(Sigma)，PBS(生工)，胰蛋白酶(生工)，蛋白酶K(Sigma)，溶菌酶(Sigma)。

酿酒酵母是公认的有益于人类的真菌，在营养条件充足的情况下它进行有丝分裂，此时的酵母以营养态细胞状态存在。显微镜镜检并统计每100个巨噬细胞吞噬营养态酵母或孢子的个数。微生物表面的糖链结构的特殊性使其被巨噬细胞所识别从而引起吞噬。1 材料与方法1.1 实验菌株作者使用高效产孢率的AⅣJ2D二倍体酿酒酵母菌株，以及ditl△和hs3△突变体菌株，均来自作者所在实验室保藏菌株，相关信息见表1。

但是，在碳源或氮源等营养条件匮乏的情况下，酿酒酵母为了传宗接代，会进行减数分裂，产4个孢子包裹于子囊中。Svk信号能够激活诸如磷脂酶C(PLC)和磷脂酰肌醇3-激酶等下游信号，从而增加吞噬效率。

作者以小鼠RAW264.7细胞作为巨噬细胞模型，研究了巨噬细胞识别和吞噬酵母孢子的作用机制，为后续探究野生型酵母孢子免疫作用提供参考。二酪氨酸层是酵母孢子壁特有的结构，其单体是由两个甲基酪氨酸分子构成。

酿酒酵母虽为与人类共生的真菌，但目前其子囊孢子形态对免疫系统的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖层被壳聚糖层和二酪氨酸层严密包裹。巨噬细胞的吞噬过程依赖于细胞表面的模式识别受体，该受体能够识别微生物表面保守的分子模式并且激活受体上酪氨酸基序。YPAce培养基：蛋白胨A20g，酵母提取物10g，腺嘌呤30mg，醋酸钾10g溶解于lL去离子水中，高压湿热灭菌。被激活的ITAM序列进一步招募脾酪氨酸激酶启动巨噬细胞的吞噬过程。1.3 培养基YPAD培养基：蛋白胨A10g，酵母提取物5g，腺嘌呤15mg溶解于450mL去离子水中，灭菌后加入50mL质量浓度为20g/dL的葡萄糖混匀。酵母孢子壁有4层，从内到外依次是甘露糖层、葡聚糖层、壳聚糖层和二酪氨酸层。

巨噬细胞对微生物表面分子模式的识别是启动直接吞噬的第一步。离心收集子囊酵母，当产孢率大于95％时，离心收集菌体，PBS洗2次，加入5mL原生质体溶液(1.2mol/L山梨醇，0.1mol/LPBS)和50L(10OOOU/mL)溶菌酶，于25℃摇床处理3h。

用培养基将母液质量浓度为lmg/mL的P13K抑制剂渥曼青霉素稀释为100ng/mL或200ng/mL。12孔板每孔接种5105个细胞，培养24h后，每孔加入相同质量的营养态酵母或者酵母孢子，每组设置5个平行，1300r/min离心3min，使酵母落到细胞表面，后续培养30min，PBS洗3次，胰酶消化收集细胞于离心管，4％多聚甲醛同定10min，PBS洗3次。

原生质体溶液洗2次，去离子水洗2次，加入5mL去离子水超声20min(45％功率，超声5s，停2s)，用0.5％吐温-20洗3次后再用去离子水洗3次。1.5 酵母培养酵母菌株于固体YPAD平板划线培养3d后，用粗头牙签接种于5mLYPAD液体培养基，转接于100mL液体YPAD培养基培养3～5h，使酵母处于对数生长期并且0D660为0.6～0.8，此时收集营养态酵母，用0.5％吐温-20洗3次后再用去离子水洗3次，3000r/min离心，称质量备用。

自然条件下，多数酵母处于营养细胞态。营养态酵母壁的几丁质成分也能刺激巨噬细胞分泌细胞因子TNF-和IL-6，并且增强巨噬细胞对假丝酵母的杀伤作用圈。营养态酵母壁的葡聚糖成分能够被巨噬细胞表面葡聚糖受体识别从而引起吞噬，促进巨噬细胞炎症因子TNF-、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的释放，葡聚糖也能够与细菌结合从而抑制细菌在胃肠道增殖从而达到抑菌的作用。之后用0.5％吐温-20洗涤3次，去离子水洗涤3次，超声30s，制备成100mg/mL的孢子悬液。

显微镜观察孢子纯化效果，将纯化后孢子制备成100mg/mL的孢子悬液。1.9高盐以及蛋白酶处理对孢子吞噬效率的影响野生型酵母孢子经高盐(0.6mol/LNaCl或1mol/LPBS)洗涤后，去离子水洗3次，离心称质量。

KAc培养基：称取20gKAc溶于1L去离子水中，固体培养基加入20g的琼脂粉，高压灭菌，倒平板。主要仪器有：细胞培养箱(Thermo)，离心机(Takara)，显微镜(日立)等。

进行抑制实验时，细胞接种于12孔板培养24h，更换为含有白皮杉醇或渥曼青霉素的培养基并于37℃孵育30min，加入1mg营养态酵母或lmg酵母孢子或200g葡聚糖微球，离心并后续培养30min，统计相对吞噬效率。蛋白酶处理野生型酵母孢子时，取野生型酵母孢子100mg，按照以下反应进行：50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/LCaCl2，加入200L蛋白酶K(600U/mL)，于37℃处理1h。

固体培养基则加入琼脂(Agar)10g一起灭菌，之后加入葡萄糖混匀，倒平板。营养态酵母细胞壁有两层，分别是内层葡聚糖层和外层的甘露糖蛋白层。这种特殊的孢子壁结构能帮助减数分裂后的细胞核抵御严酷的大自然环境，等待适宜的生长环境，从而发芽成长，再次成为营养细胞形态，维持酵母的繁衍。1.6 巨噬细胞培养和吞噬实验RAW264.7小鼠巨噬细胞置于含10％灭活牛血清的DMEM高糖培养基培养，用含EDTA的胰酶消化后传代。

1.8 无血清吞噬实验营养态酵母或孢子与巨噬细胞共培养前，更换不含血清的DMEM高糖培养基或含有10％血清的培养基处理2h，随后更换为处理组对应的培养基并分别加入lmg的营养态酵母或酵母孢子，l300r/min离心2min后共培养30min，统计吞噬效率。吞噬过程中，较大颗粒(＞2m)吞噬依赖于P13K的活性。

用培养基将母液浓度为10mmol/L的Svk抑制剂白皮杉醇稀释为25mol/L或50mol/L的工作浓度。相关链接：腺嘌呤，蛋白胨，蛋白酶K，胎牛血清声明：本文所用图片、文字来源《食品与生物技术学报》，版权归原作者所有。

营养态酵母壁上这些免疫活性物质的存在使得营养态酵母作为饲料添加物能够增强牛和猪的免疫力。酵母孢子的制备：营养态酵母过夜培养后，取10mL转接到200mL的YPAce培养基中，培养12h后离心转移到2％KAc培养基后续培养2d。